Avaliação da expressão de cxcr4 e da secreção de cxcl12 em células primárias de osteossarcoma

Abstract

Objetivo: O osteossarcoma é o câncer ósseo primário mais comum e, apesar do advento da quimioterapia, a taxa de sobrevida global é baixa, principalmente quando os pacientes desenvolvem metástase. Estudos indicam a participação do eixo CXCR4/CXCL12 no desenvolvimento de metástases e na redução da sobrevida global de pacientes com osteossarcoma. Contudo, estudos in vitro são necessários para compreender seu papel nos mecanismos de metástase e de quimiorresistência neste tumor. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão do receptor CXCR4 e a secreção de seu ligante, CXCL12, em células primárias de osteossarcoma. Foram isoladas duas culturas celulares primárias, denominadas OS1 e OS2, obtidas a partir de amostras de osteossarcoma de pacientes diagnosticados no INTO. As linhagens de osteossarcoma MG-63 e SAOS-2 foram utilizadas no estudo. As células primárias OS1 e OS2 exibiram morfologia semelhante a da linhagem MG-63, em monocamada, e apresentaram, respectivamente, tempo médio de duplicação de 75,70 horas e 29,97 horas. Foi avaliada a sensibilidade das células de osteossarcoma aos quimioterápicos doxorrubicina (DOX), cisplatina (CIS) e metotrexato (MTX) através do ensaio de MTT e do cálculo da IC50. As células OS1 apresentaram os menores valores de IC50 relacionados ao tratamento com DOX, CIS e MTX (concentrações de 0,40, 97,60 e 15,90 µM, respectivamente) sendo, portanto, as mais sensíveis. Por outro lado, as células OS2 apresentaram os maiores valores de IC50 para DOX (97,20 µM) e para MTX (2231 µM). A concentração encontrada para a CIS (257,70 µM) foi um pouco inferior ao maior IC50 (309 µM – SAOS-2). A linhagem MG-63 foi a segunda mais resistente à DOX (4,86 µM) e ao MTX (465,20 µM) e a terceira mais resistente à CIS (228,40 µM). Já a linhagem SAOS-2 foi a mais sensível ao MTX (2,05 µM), a segunda mais sensível à DOX (1,36 µM), porém, a mais resistente à CIS (309 µM). A expressão de mRNA de CXCR4 nas células OS1 foi significativamente menor em relação às células OS2 e em relação à linhagem MG-3, mas não houve diferença significativa em relação à linhagem SAOS-2. Por sua vez, as células OS2 apresentaram expressão de mRNA de CXCR4 semelhante à MG-63 e menor expressão em relação à SAOS-2 (p<0,01). No ensaio de imunofluorescência, observou-se marcação tênue de CXCR4 nas células OS1 e em SAOS-2, enquanto as células OS2 apresentaram marcação mais intensa, semelhante à MG-63. Por citometria de fluxo, verificou-se que as células OS1 apresentaram percentual de células CXCR4 menor que 1% e, nas células OS2, o percentual variou entre 1,3% e 3%. Por fim, a quantificação da secreção de CXCL12 por ELISA evidenciou baixa secreção autócrina pelas células OS1, OS2, MG-63 e SAOS-2, sem diferença entre os grupos. Em conjunto, os dados sugerem que o perfil de expressão de CXCR4 em células isoladas de osteossarcoma humano e expandidas in vitro e de células de linhagens comerciais é heterogêneo e que as células com maior expressão de CXCR4 (OS2 e MG-63) mostraram maior resistência à ação in vitro dos agentes quimioterápicos.

Objective: Osteosarcoma is the most common primary bone cancer and, despite the advent of chemotherapy, the overall survival rate is low, especially when patients develop metastasis. Studies indicate the role of the CXCR4/CXCL12 axis in the development of metastases and in the reduction of the overall survival of patients. However, in vitro studies are needed to understand its role in the mechanisms of metastasis and chemoresistance in this tumor. The aim of this study was to evaluate the expression of the CXCR4 receptor and the secretion of its ligand, CXCL12, in primary osteosarcoma cells. We isolated two primary cell cultures, called OS1 and OS2, obtained from osteosarcoma samples from patients diagnosed at INTO. The osteosarcoma lineages MG-63 and SAOS-2 were used in the study Primary cells OS1 and OS2 exhibited morphology similar to that of the MG-63 line, in monolayer, and presented, respectively, mean duplication time of 75.70 and 29.97 hours. The sensitivity of osteosarcoma cells to the chemotherapy drugs doxorubicin (DOX), cisplatin (CIS) and methotrexate (MTX) were assessed by MTT assay and IC50 calculation. OS1 cells had the lowest IC50 values related to treatment with DOX, CIS, and MTX (concentrations of 0.40, 97.60 and 15.90 μM, respectively) and were, therefore, the most sensitive. On the other hand, OS2 cells had the highest IC50 values for DOX (97.20 μM) and for MTX (2231 μM). The concentration found for CIS (257.70 μM) was slightly lower than the higher one (309 μM - SAOS-2). The MG-63 strain was the second most resistant to DOX (4.86 μM) and MTX (465.20 μM) and the third most resistant to CIS (228.40 μM). The SAOS-2 strain was the most sensitive to MTX (2.05 μM), the second most sensitive to DOX (1.36 μM), but the most resistant to CIS (309 μM). The expression of CXCR4 mRNA in OS1 cells was significantly lower in OS2 cells and in relation to the MG-3 lineage, but there was no significant difference in relation to the SAOS-2 lineage. OS2 cells, on the other hand, showed CXCR4 mRNA expression similar to MG-63 and less expression in relation to OS-2 (p <0.01). In the immunofluorescence assay, weak CXCR4 labeling was observed in OS1 and in SAOS-2, whereas OS2 cells showed more intense labeling, similar to MG-63. By flow cytometry, it was found less than 1% of CXCR4 positive cells for OS1 while for OS2 the percentage ranged between 1.3% and 3%. Finally, the quantification of CXCL12 secretion by ELISA showed low autocrine secretion by OS1, OS2, MG-63 and SAOS-2 cells, with no statistic difference. Together, the data suggest that the expression profile of CXCR4 in primary osteosarcoma cells and in commercial lineages is heterogeneous and that the cells with higher expression of CXCR4 (OS2 and MG-63) show higher resistance to the in vitro action of chemotherapeutic drugs.