Avaliação da citotoxicidade do DAN29 em células humanas IN VITRO: condrócitos, células estromais da medula e células cancerígenas HEP-2

Abstract

Objetivo: A inflamação e uma resposta em caso de infecções e é a responsável por combater os agentes agressores e promover a recuperação do tecido atingido. O processo inflamatório na osteoartrite (OA) causa a destruição dos conócitos, que são as células que constituem a cartilagem. A incidência da OA, em escala mundial, e estimada em 300 milhões de pessoas acometidas por esta doença. Existem relatos de um custo anual em torno de 303 bilhões de dólares nos Estados Unidos, com programas de saúde e por perda de renda, para atender aproximadamente 30,8 milhões de adultos acometidos por esta doença. O tratamento medicamentoso e feito com o uso de anti-inflamatorios, sendo os do tipo nao esteroidal (AINEs) os mais utilizados. Porém, o tratamento com os AINEs não coibe a ação de todos os agentes pro-inflamatorios e apresenta efeitos adversos indesejados. Com este pensamento, a comunidade cientifica esta sempre buscando novos anti-inflamatorios. Foi sintetizado o DAN29, que e um potente bloqueador seletivo para o receptor pro-inflamatorio P2X7. O objetivo deste projeto foi avaliar a citotoxicidade do DAN29, quanto a morte celular e danos as funcoes mitocondriais em três tipos de celulas humanas, sendo elas os condrocitos, as células estromais da medula e as células HEp-2, atraves de ensaios in vitro usando as tecnicas Live and Dead e MTT. Foram realizados ensaios em que as celulas humanas foram submetidas a variadas concentrações do DAN29 (10-9M, 10-7M, 10-5M e 10-3M) e diferentes tempos de exposição (24h, 48h e 72h). No ensaio Live and Dead com condrocitos, celulas estromais da medula e celulas HEp-2 não foi observada alteração estatisticamente significativa na morte celular em exposicao de 24h, 48h e 72h (p > 0,9). Os ensaios da tecnica MTT com os condrocitos e as celulas estromais nao mostraram diferença estatistica entre as condições controle e exposição ao DAN29 nos diferentes tempos de exposição (p>0,5). Ja para as celulas HEp-2, todas as concentracoes de DAN29 nos tempos de 24h, 48h e 72h apresentaram reducao da atividade mitocondrial (p<0,05). Considerando que este tipo celular e uma linhagem cancerigena, tal efeito pode ser relacionado a caracteristica proliferativa desta celula. Em geral, nos demais tipos celulares, o DAN29 apresentou baixa citotoxicidade e indução de morte celular. Assim, apontamos o DAN29 como um composto promissor para ser utilizado no tratamento da OA; porém outros estudos devem ser realizados para corroborar a segurança no uso clinico deste farmaco.

Objective: Inflammation is a response in case of infections and is responsible for fighting the aggressor agents and promoting the recovery of the affected tissue. The inflammatory process in osteoarthritis (OA) causes the destruction of chondrocytes, which are the cells that make up cartilage. The incidence of OA, worldwide, is estimated at 300 million people affected by this disease. There are reports of an annual cost of around 303 billion dollars in the United States, with health programs and for loss of income, to assist approximately 30.8 million adults affected by this disease. The drug treatment is done with the use of anti-inflammatory drugs, the nonsteroidal type (NSAIDs) being the most used. However, treatment with NSAIDs does not inhibit the action of all pro-inflammatory agents and has unwanted side effects. With this thought, the scientific community is always looking for new anti-inflammatory drugs. DAN29 was synthesized, which is a potent selective blocker for the pro-inflammatory receptor P2X7. The aim of this project was to evaluate the cytotoxicity of DAN29, regarding cell death and damage to mitochondrial functions in three types of human cells, these being chondrocytes, marrow stromal cells and HEp-2 cells, through in vitro assays using Live and Dead and MTT techniques. Assays were carried out in which human cells were subjected to varying concentrations of DAN29 (10-9M, 10-7M, 10-5M and 10-3M) and different exposure times (24h, 48h and 72h). In the Live and Dead assay with chondrocytes, marrow stromal cells and HEp-2 cells, no statistically significant change in cell death was observed in 24h, 48h and 72h exposure (p > 0.9). The MTT technique assays with chondrocytes and stromal cells showed no statistical difference between control conditions and exposure to DAN29 at different times of exposure (p>0.5). As for HEp-2 cells, all concentrations of DAN29 at times of 24h, 48h and 72h showed a reduction in mitochondrial activity (p<0.05). Considering that this cell type is a cancerous lineage, this effect can be related to the proliferative characteristic of this cell. In general, in other cell types, DAN29 showed low cytotoxicity and induction of cell death. Thus, we point out DAN29 as a promising compound to be used in the treatment of OA; however, other studies must be carried out to confirm the safety in the clinical use of this drug.